단백질 분석

단백질 정제는 기능을 이해하기 위한 첫 단계임

 

단백질은 세포로부터 얻어져야 함

1. 원심분리법 - 밀도가 더 큰 물질은 원심력이 더 높다

 

2. 염석법 - ammonium sulfate를 서서히 단백질 샘플에 넣어 원하는 농도에서 침전되거나 침전되지 않은 상태의 단백질 용액을 얻어냄 - 다음 단계인 투석법으로 넘어감

 

단백질은 용해도, 크기, 전하, 결합 친화성 기준 분리 가능

 

3. 투석법 - 투석 셀룰로오스 막의 구멍보다 더 큰 단백질은 내부에 남음. 작은 분자들과 이온들은 막 구멍 통과

 

4. Gel-filtration chromatography

이동상과 정지상 분배의 차이로 각각 분리되는 분리 분석법. 기체/액체 크로마토그래피로 나뉨

 

5. Ion-exchange chromatography

단백질의 양이온과 음이온에 대한 차이로 분리

*이후 염석법 이용해 붙은 단백질 pi 이용해 2차 분리

 

6. Affinity chromatography(친화크로마토그래피)

글루코오스의 양이 증가하면 붙어있는 단백질을 분리시킴

*더 증가할경우 침전(2차 분리)

 

7. HIS-TAG(친화크로마토그래피)

ATG - 시작 코돈 / TAG - 중단 코돈

 

8. 고압 크로마토그래피

압력을 가해 단백질을 대롱에 통과, 220 nm에서 검출

대롱 - 친화, 이온, 크기로 분류

UV 라이트를 이용하는데, 분자량이 달라 흡광도가 다른 것을 이용함

 

9. Gel electrophoresis

 SDS(sodium dodecyl sulfate) 계면활성제 이용해 -전하로 코팅, 젤에 전류를 흐르게 해 단백질을 흐르게 함

사이즈로 분리

*Comassie blue로 염색함. 이온 결합과 반데르발스 힘으로 amine group에 결합

*크기가 같을 경우 종류가 하나보다 더 많을 수 있음

크기가 작을수록 젤에서 더 빠르게 이동

 

10. Isoelectric focusing

등전점 이용, pH를 조정한 전류 판 위에서 이동시킴

 

11. Two-dimensional electrophoresis(이차원 전기이동)

젤크로마토그래피 + 등전점 포커스 방식

 

분석법

 

에드만 분해법

아미노산의 조성은 알 수 있으나, 순서는 알 수 없음 (이온크로마토그래피, 흡광도로 측정)

N 터미널에서부터 순차적으로 이소티오시안산 페닐이 하전되지 않은 말단의 아미노기와 반응, 페닐티오카르바모일 유도체 형성 후 고리형 유도체로 분리

 

*효소로 단백질을 쪼개서 분석하는 것도 가능함

 

Mass Spectrometry

단백질의 질량은 MS 기법으로 분석 가능

헬륨, 아르곤 비활성 원자로 펩타이드 사슬을 쪼갤 수 있다

펩타이드들을 가장 작은 질량 순서대로 나열해서 빼 보면, 순서대로 구할 수 있음